1- Techniques d'imagerie pour le vivant

La connaissance des propriétés des photons et de la lumière laser (confinement spatial, temporel, couverture spectrale), et aussi des propriétés optiques propres aux milieux vivants (absorption, autofluorescence, diffusion, réfraction, anisotropie) a permis à de nouvelles techniques d'imagerie du monde biologique de voir le jour au cours des dernières années.

Parmis ces techniques, on peut citer les plus innovantes, tirant parti des nouvelles méthodes de détection des signaux optique (imagerie spectrale ou Raman, accousto-optique, cohérence) et aussi celles utilisant les propriétés optiques non-linéaires de certains matériaux et leur réaction aux fortes puissances des laser pulsés YAG ou Saphir-Titane femtoseconde (génération de seconde harmonique et absorption à deux photons).

Malgré toutes ces techniques, les plus répendues restent les méthodes photoniques et biphotoniques faisant appel à la fluorescence de marqueurs moléculaires (par exemple la GFP : Green Fluorescent Protein). Ces techniques sont de puissants outils aussi bien d'imagerie des systèmes "in-vivo" que des outils thérapeutiques.

2- Absorption et fluorescence à deux photons

* Principe d'absorption et fluorescence

On entend par absorption et fluorescence les processus de transtions entre niveaux d'énergie atomiques produites par l'absorption par l'atome (ou la molécule) ou l'émission d'un photon d'énergie égale à la différence d'énergie entre les deux niveaux impliqués dans la transition.

1^ére étape :

Un photon incident d'énergie hn, n étant la fréquence du photon, arrive sur un atome initialement dans un état d'énergie E0 et ayant deux état d'énergie accessible en plus de son état initial.

2^ème étape :

L'atome absorbe le photon et atteint ainsi le niveau E2 tel que E2-E0=hn. C'est l'absorption.

3^ème étape :

L'atome après un temps bref d'attente sur le niveau E2, dit état métastable, l'atome se désexcite une première fois non radiativement vers l'état E1 puis se désexcite vers l'état E0 en émettant un photon d'énergie hn=E1-E0. C'est l'émission spontannée encore appelée fluorescence.

Dans la majeur partie des cas, dans les conditions linéaires, seul un photon est absorbé à chaque fois et l'énergie du photon réémis par fluorescence est inférieure à l'éergie qui a emmenée l'atome vers son état excité.

* Absorption et fluorescence à deux photons

Dans le cas très singulier où les photons incidents sont en très grande concentration, obtenu en focalisant un faisceau laser très intense (de type YAG ou Sa-Ti), il existe une probabilité importante qu'au point de focalisation du laser (waist), il y ait absorption de deux photons simulténament. Cet effet est dû aux propriétés non-linéaires qui règnent au point focal du fait de la très forte concentration d'énergie.

N.B. : Cet effet est compatible avec les lois dictées par la mécanique quantique.

1^ère étape :

Deux photons, au point de focalisation d'un laser de forte intensité, de même énergie arrivent sur un atome.

2^ème étape :

Simultanément, l'atome absorbe les deux photons incident du fait de la forte densité d'énergie règnant au point de focalisation du laser. L'atome se retrouve alors sur l'état d'énergie E< sub> égale à la somme des énergiesdes deux photons incidents. C'est l'absorption à deux photons.

3^ème étape :

L'atome se désexcite d'abord non radiativement vers un état d'énergie intermédiaire puis se désexcite vers son niveau fondamental en émettant un photon d'énergie hn=Ei-E0 supérieure à l'énergie des photons incidents. C'est la fluorescence par désexcitiation des états créés par excitation à deux photons.

L'absorption et la fluorescence à deux photons sont donc des effets non-linéaires permattant d'obtenir des photons de fréquence plus élevée que les photons excitateurs.

3- Microscopie de fluorescence

La microscopie de fluorescence est une technique de microscopie utilisanty les propriérés de fluorescence de certaines molécules afin d'obtenir des images de système très petits de type cellules.
Le principe est d'imlanter dans une cellule une molécule marqueur fluorescente (le plus commun est la GFP) puis d'envoyer des photons sur cette cellule afin de venir exciter les propriétés de fluorescence du marqueur.
Le but de cette technique est de pouvoir détecter la présence du corps marqué parmi d'autres particules ou encore en marquant plusieurs composant avec des molécules produisant des fluorescence de couleur différente, de pouvoir suivre l'évolution d'une interaction entre deux cellules. C'est la technique d'imagerie biologique de prédilection.

Visualisation des étapes de l'endocytose d'une amibe marquée à la GFP 

 
Marquage fluorescent du cytosquelette d'un keratocyte

La microscopie de fmuorescence à un photon ne permet d'étudier que des systèmes dans leur ensemble sans pouvoir imager une région particulière en trois dimension. Nous allons voir maintenant qu'une technique vieille de tout juste 10 ans va permettre d'effectuer des images très précises dans des condition très particulières propres aux systèmes vivants.

4- Microscopie de fluorescence à deux photons

La microscopie de fluorescence à deux photons est basée sur l'effet non-linéaire de fluorescence par excitation biphotonique.
C'est une technique très puissante d'imagerie des systèmes "in-vivo". Elle est, à l'heure actuelle, certainement la méthode la méthode la plus fine d'imagerie des systèmes vivants non contraints (immobilsés pour s'afranchir des effets liés à la motilité des organismes).
Elle consiste à injecter un marqueur possédant des propriétés de fluorescence à deux photon dans un organisme puis de focaliser un faisceau laser intense sur le point dot on souhaite obtenir une image. De part sa nature (très grande cohérence spatiale et temporelle, mode gaussien), la lumière émise par un laser peut être focalisée en point de très faible diamètre (de l'ordre du miromètre, allant jusqu'à des diamètres de faisceau proches de la longueur d'onde). De ce fait, le volume où siègent le propriétés d'absorption non linéaire est très petit, ce qui autorise une excellente résolution dans l'imagerie (proche du µm). De plus, le laser étant un faisceau très parallèle et peu divergent, il suffit de déplacer une lentille (ou un objectif de microscope) sur son trajet pour disposer ainsi d'un point focal mobil et pénètrant de quelques µm les tissus vivants. Ceci va donc permettre de réaliser une image à trois dimensions d'un système vivant, in-vivo, et d'imager des couches intrnes.